近期，何祖平研究团队最新研究发现，YAP1通过与RAD21相互作用，并靶向NEDD4调控人精原干细胞的命运决定和男性不育。相关成果以“Essential Regulation of YAP1 in Fate Determinations of Spermatogonial Stem Cells and Male Fertility by Interacting with RAD21 and Targeting NEDD4 in Humans and Mice”为题发表在Research上。
一、研究背景
近年来我国人口出生率逐年下降，不孕不育是该社会问题的重要原因。其中，由男性因素所致的不孕不育约占50%。精原干细胞（Spermatogonial stem cells, SSCs）作为精子发生的起始细胞，其精自我更新与分化的动态平衡对精子发生至关重要。然而，目前精原干细胞命运决定的机制尚不清楚，进行精原干细胞命运决定的机制研究可为揭示精子发生障碍的病因提供重要的科学依据。
研究表明，Yes相关蛋白1（Yes-associated protein 1，YAP1）参与了肿瘤发生、干细胞（胚胎干细胞、间充质干细胞、肠道干细胞等）自我更新与分化、胚胎发育、器官大小调节及细胞可塑性等多种生物学过程。然而，目前尚无YAP1参与人精原干细胞命运决定的相关研究。
二、研究进展
作者团队前期研究发现PAK1可通过PDK1等靶基因调控人精原干细胞的命运。作者将人精原干细胞PDK1敲低后，YAP1基因和蛋白表达量下降，提示YAP1可能在人精原干细胞命运调控中发挥重要作用。
首先，作者对777例生精障碍患者的全外显子测序数据进行了生物信息学分析，发现了16例患者中存在12处YAP1基因单核苷酸变异（Single nucleotide variation，SNV）（2.06%，16/777），包括1例纯合突变及15例杂合突变，均为新发变异或罕见变异。随后对上述变异进行了患病风险分析及致病性预测，结果筛选出2处可能的有害变异，即YAP1c.134C>T（p. P45L），YAP1c.680C>T（p. S227L）。INPS-MD、MAESTROweb服务器预测显示，这2处YAP1基因SNVs均损害YAP1蛋白质结构的稳定性。接下来，作者在人精原干细胞系中构建了YAP1 P45L、S227L突变体，观察突变体对YAP1蛋白质表达及细胞功能的影响。蛋白质稳定实验显示，YAP1 S227L突变体降低YAP1蛋白质的稳定性，而YAP1 P45L对蛋白质稳定性影响不明显。功能实验表明，与野生型相比，YAP1 S227L突变体的人精原干细胞的DNA合成减少，凋亡增加，YAP1 P45L对人精原干细胞增殖和凋亡无明显影响。同时，作者发现，非梗阻性无精子症患者睾丸组织中YAP1蛋白表达量降低（图1）。可见，YAP1突变或低水平表达与人类非梗阻性无精子症存在相关性。
图1. YAP1 SNVs与非梗阻性无精子症的相关性
接下来，作者在体内外水平分别论证了YAP1敲低可抑制人精原干细胞系的增殖和DNA合成，促进其凋亡（图2）。
图2. YAP1敲低对人精原干细胞生物学功能的影响
作者通过RNA测序、免疫沉淀结合质谱分析（IP-MS）发现，YAP1可通过与转录因子RAD21相互作用，靶向NEDD4调控人精原干细胞的命运。采用Co-IP、双荧光素酶基因报告实验等技术论证了YAP1、RAD21及NEDD4三者的相互关系（图3）。
图3. YAP1、RAD21及NEDD4在人精原干细胞中存在相互作用
功能实验结果表明，YAP1下游靶基因NEDD4可促进人精原干细胞系的增殖和DNA合成，抑制其凋亡（图4）。
图4. NEDD4敲低对人精原干细胞生物学功能的影响
为进一步论证YAP1在体内水平对精原干细胞命运的影响，作者构建了雄性生殖细胞YAP1特异性敲除（Yap1cKO）小鼠。作者发现，雄性生殖细胞YAP1特异性敲除可导致小鼠生精障碍。组织免疫荧光显示，Yap1cKO小鼠睾丸生精小管内精原干细胞标记物UCHL1、未分化精原干细胞标记物PLZF、已分化精原细胞标记物c-Kit及增殖细胞核抗原PCNA阳性数量减少；TUNEL染色显示，Yap1cKO小鼠睾丸组织切片中TUNEL阳性生殖细胞数量增多（图5）。
图5.雄性生殖细胞Yap1条件性敲除对精原干细胞自我更新和生殖细胞凋亡的影响
有趣的是，作者发现Yap1cKO小鼠呈现出少弱畸形症（图6）。
图6.雄性生殖细胞Yap1条件性敲除对小鼠精子的影响
三、未来展望
在本研究中，作者论证了YAP1/RAD21/NEDD4对人精原干细胞命运的重要调控作用，并发现YAP1基因SNVs或低表达与非梗阻性无精子症的相关性。YAP1蛋白质是一个高度保守的蛋白，有可能作为精子发生障碍的标记物或治疗靶点。本研究为人类精子发生的遗传调控机制提供了新的见解，并为男性不育的诊治提供了新的靶点。
